|
Новая технология иммобилизации биологи-чески активных соединений на целлюлозе (получение безлактозного молока) ВВЕДЕНИЕ Мультидоменные (мультимодульные) белки, гидролизующих природные полисахариды, помимо каталитического домена содержат один или несколько некаталитических, соединённых гибкими линкерными последовательностями. Такие белки можно представить себе в виде шариков соединённых ниткой, где шарикам соответствует глобуляные модули (домены), а нитке – линкер. Большинство некаталитических доменов представляют собой субстрат-связывающие, в частности, целлюлозо-связывающие домены (ЦСД). На рис. 1 приводится схема структуры мультидоменной целлюлазы термофильной анаэробной бактерии. Некоторые ЦСД в изолированном состоянии способны к прочному связыванию с определёнными формами целлюлозы. Таким образом, создание гибридных плазмид с фрагментом ДНК, кодирующим ЦСД, позволит легко иммобилизовать любой биологически активный белок на целлюлозе с сохранением биологической активности этого белка. В ИМГ РАН был изолирован и изучен ЦСД CelD. Показано, что этот ЦСМ прочно связывается с различными формами аморфной целлюлозы в строго определенных условиях. Белок возможно элюировать с целлюлозы также лишь при определенных условиях (рН 13, 100 % формамидом и 1% додецил сульфатом натрия). Разработан простой и эффективный способ очистки ЦСМ и слитных с ним белков. Эффективность очистки составляет 95-99%. Слитные с ЦСМ белки, по способности к адсорбции на целлюлозе, не отличались от свободного ЦСМ. Максимальное количество белка связывающегося с аморфной целлюлозой составляло 400-500 мг/г целлюлозы. Т. о. в химерных белках сохранялись адсорбционные свойства ЦСМ и положение дополнительного белка не оказывало влияние на способность гибридного белка связываться с целлюлозой. Показана возможность использования ЦСМ CelD для очистки и иммобилизации химерных белков. Эффективность очистки составляет 95-99%. Сконструированы экспрессионные вектора содержащие ЦСМ CelD и спейсерные последовательности, необходимые для получения активных химерных белков (рис. 2). На их базе создана рекомбинантная плазмида, продуцирующая лактазу (бета-галактозидазу). О ПРИМЕНЕНИИ ТЕХНОЛОГИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЦЕЛЛЮЛОЗО-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА ДЛЯ ГИДРОЛИЗА ЛАКТОЗЫ С помощью рекомбинантной плазмиды в клетках E. coli получены слитные белки, содержащие целлюлозо-связывающий домен (ЦСД) целлюлазы CelD и бета-галактозидазу (лактазу). Лактаза способна расщеплять лактозу, которая содержится в молоке и в целых регинах Земли (в частности, в Юго-Восточной Азии) является одной из причин плохого усвоения молока. В составе химерного белка как бета-галактозидаза (лактаза), так и ЦСД сохраняли свои свойства. Слитные белки прочно, практически необратимо, связывались с аморфными формами целлюлозы. На 1 г аморфной целлюлозы возможно нанести 450 мг химерного белка, при этом достигается прочное связывание белка с носителем без обработки фиксирующими агентами. В иммобилизованном состоянии повышается стабильность белков. Создан модельный проточный реактор колоночного типа для гидролиза лактозы в молоке с помощью лактазы иммобилизованной на целюлозе (Рис. 3). Показана высокая эффективность работы реактора: при протекании 150 мМ (5 %) раствора лактозы со скоростью 1 объем реактора в минуту достигается 75 % степень гидролиза лактозы, считающаяся оптимальной для последующей переработки молочной сыворотки. Пропускание через реактор 10000 объемов колонки при скорости потока 1 объем колонки в минуту и температуре 70°С не приводит к снижению эффективности расщепления лактозы. Хранение реактора при комнатной температуре в течение 6 месяцев не приводит к изменению параметров реактора. ПРЕИМУЩЕСТВА ДАННОЙ ТЕХНОЛОГИИИ Основным преимуществом комбинации ЦСД-сорбент (целлюлоза) является низкая стоимость сорбента и многообразие его форм (кристаллическая, аморфная, растворимая и различные продукты-модификации). Кроме того, целлюлоза является экологически безопасным биологически инертным веществом. В некоторых случаях комбинация ЦСД-целлюлоза характеризуется высокой константой связывания, стабильным взаимодействием в течение продолжительного срока в широком диапазоне растворов с различной ионной силой (10 мМ - 1 М) и температур (10-50ОС), и, в большинстве случаев, простотой диссоциации. С помощью ЦСМ CelD возможна одностадийная очистка и прочная иммобилизация рекомбинантных белков на аморфной целлюлозе без дополнительной химической обработки. Целлюлоза является идеальным носителем в связи с её дешевизной и отсутствием токсичности. Химерные белки с ЦСМ могут быть иммобилизованы на целлюлозе из неочищенных лизатов, что упрощает работу и особенно существенно для белков склонных к агрегации. |
